时间估计是大脑的一项基础功能，许多关键认知功能（如运动控制或短期记忆）的执行均依赖时间估计。在过去几十年对大脑时间估计的神经机制研究中，报道了几种编码时间的可能模式（“时间码”）[1]：1. 单调渐变活动（ramping dynamics）：一组特定神经元的活动随时间的流逝，呈逐渐升高或下降的状态（图1a）；2. 序列活动（sequential activity）：一群特定神经元的活动峰值出现在特定的时间，根据时间的进程特定的神经元集群呈现出有序的活动模式（图1b）。有趣的是，研究发现，在编码不同长度时间的细胞数量保持不变的情况下，这些“时间编码”模式可以表现出缩放（scaling）特性，神经活动模式可以根据预估的目标时间的长短进行拉伸或缩短。然而，以往研究的实验方案中，由于动物被要求学习估计固定的时间，通常仅仅关注一种或两种类别的时间伸缩现象。在单个试次的精度上，缺乏缩放现象的证据。因此，神经编码缩放是否支持时间估计的证据仍不完整。
（图源：Tsao, et al., Nat Rev Neurosci, 2022.11） 近日，由来自南昌大学的马朝林团队、复旦大学的袁鹏团队及杭州师范大学的李葆明团队合作在eLife上发表了题为“Stable sequential dynamics in prefrontal cortex represents subjective estimation of time”的评议预印本(reviewed preprint)。研究者采用了一种新的计时任务，让大鼠自主控制等待时长，结合单细胞精度的活体钙成像，得以观察在单个试次水平，时间编码的缩放与等待行为的相关性。研究者发现，当大鼠执行计时任务时，内侧前额叶皮层（mPFC）表现出与等待时间相关的序列活动模式。他们首次报道了，序列活动的缩放效应可以在单个试次的时间精度上准确地反应预估时长。有趣的是，他们进一步发现编码序列活动的神经元的编码模式在数周内保持稳定，而与任务其他特征相关的细胞则存在较高的动态变化。 在本研究中，大鼠执行计时任务时探鼻时间越长获得的饮水奖励越大，大鼠自主选择在单个试次内的探鼻时间。这一行为学范式使得研究者可以观察大鼠mPFC神经元的动态活动在不同等待时长中的变化（图2A）。为了避免探鼻动作相关的神经元混杂在计时相关的神经元中，他们分割出了探鼻开始神经元（start cell）、探鼻结束神经元（end cell）和计时神经元（duration cell）（图2B）。有趣的是，将探鼻时长统一到标准化时间后，计时细胞的活动时间也随之偏移（图2B右）。研究者用计时细胞的钙活动建立了时间进程的估计模型（图2E、F），验证了计时细胞的序列活动模式中包含有等待时间的信息（图2E、F）。除此之外，用start cell和end cell的活动训练支持向量机模型（SVM）能以90%以上的准确率预测大鼠是否在探鼻（图2C、D），这表明它们的活动对探鼻事件的高度特异性。这些结果表明mPFC中存在不同的细胞群编码时间任务的不同特征。在标准化时间尺度中，计时细胞对特定时间点表现出选择性激活，其每个试次间的实际活动根据探鼻时长进行伸缩。图2. 单个试次分辨率下mPFC序列活动随探鼻时间的缩放
之前的研究报道，海马的序列活动模式可以代表事件的时间顺序。有趣的是，这些序列是高度动态的[2]。因此，研究者随后研究了在mPFC中观察到的时序序列活动是否在不同天中显示出相似的不稳定性。在间隔多天的不同检测中，研究者仍可以看到计时细胞保持它们的编码特征。大约70%的计时细胞在不同天中保持其稳定性。在这些稳定的计时细胞中，超过70%的计时细胞在不同天中仍然编码标准化时间尺度中的同一时间点(图3C)。使用对齐后的计时细胞活动进行时间预估模型的运算，在不同天的数据集中仍可以对等待时间进行准确的解码 (图3D)。与计时细胞不同，编码探鼻开始和结束的细胞是高度动态的，低于30%的起始细胞或结束细胞在不同天继续保持相同的编码类型(图3A)。这些结果表明计时细胞中的序列活动模式稳定地编码时间，并且不受经历的时间或任务结构的影响。这种稳定性特异性地出现在计时细胞当中，提示了它们可能是一类特定的细胞亚群。之前对海马和皮层的研究均显示了不同天数内的不稳定序列模式[2,3]，本项研究的数据首次表面明了大脑内可能存在稳定的时间编码。图3. mPFC计时神经元的活动序列长期且稳定地编码时间 在发现mPFC中表现出与时间相关的稳定序列活动后，他们下一步研究了该活动是否可以作为该任务时间估计的神经机制。之前的研究表明，大鼠mPFC降温会干扰其在需要时间的任务中的表现[4]。然而，时间估计错误与单细胞水平神经活动的关系还未有探讨。本项研究进一步对大鼠的错误试次进行分析，将mPFC中的神经活动错误归纳为以下三种形式：I型，由于大鼠注意力不集中或脱离导致的神经活动缺失；II类为存在神经活动，但其发放无序列性；III型，序列编码完整但估计目标时间的缩放错误。为区分神经活动中的不同错误类型，他们将每个试次中的神经活动投射到标准化时间方向，发现几乎所有试次均显示出相似的轨迹，表明没有上述I型错误（图4A）。利用时间估计模型预测标准化目标时间，未发现正确和错误trial之间有显著差异（图4D），表明没有II型错误。当研究者使用基于神经活动的时间估计模型的累积误差与实际等待时长作图，错误的试次显示了累计预估偏差过短的集群，而正确的试次显示累计预估偏差较长的集群（图4E），这表明大鼠行为学上的错误与神经序列活动的缩放估计有关。令人惊讶的是，累积误差极性逆转的探鼻时间为1500 ms，恰好是大鼠接受奖励所需的最小时间阈值。这一结果提示，大鼠可能通过自主调整缩放因子改变mPFC序列活动的尺度从而完成时间估计任务。图4. 时间估计中的错误行为可归因于mPFC中的序列缩放错误 本研究主要探讨了大鼠mPFC中神经元的序列活动与时间估计的紧密联系。研究团队的结果表明计时神经元能够实时调整序列活动，并且迅速地反映每个试次探鼻时间的变化。与此同时，这些序列活动在数周后仍然保持稳定。并且，大鼠mPFC序列活动能够感知任务期间的最小时间阈值和自主调整缩放因子。该研究结果提供了序列活动和计时功能之间更精细的相关性，这些序列活动很可能是时间估计的神经编码。由于操控单细胞水平的技术尚不完善，序列活动与时间估计间的因果性还缺乏直接的实验证据。
Jiannis Taxidis（助理教授，加拿大多伦多大学生理学系）This exciting study reveals an intriguing link between internal time estimation and sequential cell activation in the cortex. The authors used calcium imaging in the prefrontal cortex of freely moving rats engaged in a self-timed nose-poking task. During poking, some cortical cells were activated in sequence, with each cell’s activation time shifting depending on the total duration of the nose poke. In other words, such a “duration cell” would fire earlier in a shorter poke and later in a longer poke, keeping a fixed timing relative to the total poke time. Therefore, these cells may be actively engaged in timing the poke, unlike similar sequences of “time cells” in the hippocampus which encode absolute time and change their firing if a delay interval is altered (Taxidis et al. 2020). In another interesting contrast with the hippocampus - where time cells alternate across days (Taxidis et al. 2020 ）- duration cells in the cortex often retained stable time coding for multiple sessions. Intriguingly, in error trials (where the rat ended its poke too soon) sequences of duration cells played out too fast, in essence estimating time a little too short. Future recordings with electrophysiology, rather than imaging, will allow examining such spiking dynamics with higher temporal resolution, whereas single-cell optogenetic perturbations will tackle the causal role of these duration cells in timing estimation directly.（译文）这项研究令人十分兴奋，它揭示了大脑内在时间估计功能和皮层中神经元有序激活之间的有趣联系。作者在大鼠执行一项自主计时的探鼻任务时，对其前额叶皮层进行了钙成像。在探鼻的过程中，一些皮层细胞被依次激活，每个细胞的激活时间随维持探鼻的总时间而变化。换句话说，这种“计时细胞”会在较短的探鼻时间中较早激活，在较长的探鼻时间中较晚激活，相对于总的探鼻时长而言细胞却在一个固定的时间点被激活。因此，这些前额叶皮层细胞可能积极参与了探鼻的主动计时，这与我们之前所报道的海马体中的“时间细胞”序列不同。海马中的细胞编码绝对时间，并在这个绝对时间改变时改变其放电模式（Taxidis et al. 2020）。另一个有趣的差异是，海马中的“时间细胞”序列在不同的日子里发生了转变（TTaxidis et al. 2020），而皮层中的计时细胞通常在多天后仍保持稳定的时间编码序列。有趣的是，在错误的试次中，计时细胞的细胞序列发生太快，其本质上是大鼠过短地估计了时间。在未来的研究中，应用电生理记录将允许以更高的时间分辨率检查这种放电的动力学，而单细胞光遗传调控将可以直接检验这些计时细胞在时间估计中的因果作用。
原文链接：https://elifesciences.org/reviewed-preprints/96603v1
